农杆菌电击转化之方法

1 准备材料

准备好以下物质：

• 农杆菌之质粒载体
• 预备转基因之RNAi或过表达质粒载体
• 电击仪 和 电击杯（电击杯需要用酒精提前侵泡1H，之后用ddH2O洗净内部后用滤纸擦，电击仪设置为manual为2.5V,倒写F的也为2.5V，调为倒写F，需要上下键一起按动）
• 加入Stre and Spe（每1000mlLB固体培养基中两抗生素各加100μL） 之LB培养基板子（每基因之一个处理（RNAi或过表达）前后至少需要2个板子）
• 涂菌棒
• LB液体
• 移液枪
• 冰盒

2 电转化

在超净台内进行如下操作：

1. 将33μL的农杆菌质粒载体(K599为根毛转化用，GV310D为叶片转化用)所在离心管插入冰盒内。
2. 将所需要转基因之质粒载体(RNAi或过表达质粒载体)加入到上述之离心管。若该质粒浓度低加入2μL，浓度高（>100ng/μL）加入1μL。注意需要旋转枪头加入。
3. 将混合后的液体全部加入至电击杯后，盖好盖子，移出超净台，放入电转仪（电击杯之金属一端需对电击仪槽内金属端），按住power键电击，取出后，外表面喷酒精放回超净台，加入原离心管。
4. 将电转后的液体静置10min。
5. 朝所有离心管内加入1000mlLB液体，放入37℃摇床摇3H后涂板。

3 涂板子、检测阳性、摇菌

1. 将摇好的菌液，取10μL加入新离心管，新管内再加10μLSpe抗生素，再加200μLLB液体，震荡混匀后，再将全部液体涂至前述Stre and Spe板子上，至涂抹干为止。盖好盖子，写好标记（人名，基因名，抗生素，时间）封口膜封口。放到3楼28℃的培养箱（培养基面朝上），培养48H以上取出，观察是否有单克隆。
2. 若有单克隆，挑单克隆划线，进行菌液阳性检测，用克基因所用的引物，检测体系同以往之教程。
3. 若有阳性，摇菌，同另外教程【摇菌流程（保菌，提质粒用）.md】所述，不同之处在于需要摇48H，所用摇床也为3楼之28℃的摇床。该步骤所得之质粒需要保菌，后再涂至同样的spe+stre的板子，进行根毛转化。