酵母异源表达实验流程

酵母感受态制备及转化方法

| 顺序 | 工作 | 最佳时间点 |
| —- | —- | |
| ① | 挑INVSCI（酵母的感受态菌株，可为其他菌株，如Na^+^，K^+^，Cl^-^敏感的菌株）单克隆或其菌液10微升至YPD液体培养基。30℃摇床过夜培养。 | Day 0 18:00 |
| ② | 测定菌液OD600，将菌液按1：10的比例加入YPD液体培养基中，30℃摇2-4h保证菌液OD=0.4； | Day 1 8:00 |
| ③ | 2500rpm室温离心5min，弃上清；加入40 mL 1×TE重悬菌体沉淀，2500rpm室温离心5min，弃上清； | Day 1 12:00 |
| ④ | 加2 mL 1×LiAc/0.5×TE重悬菌体沉淀 | Day 1 12:00 |
| ⑤ | 室温静置孵育10min，每管分装100 μL； | Day 1 12:00 |
| ⑥ | 分别加入10 μL鲑鱼精+1 μg质粒，移液枪抽吸混匀； | Day 1 12:00 |
| ⑦ | 加入700 μL 1×TE/40%PEG-3350/1×LiAc，高速混匀（10s1min内） | Day 1 12:00 |
| ⑧ | 30℃水浴锅孵育30min； | Day 1 12:00 |
| ⑨ | 加入DMSO 88 μL,轻轻颠倒混匀，42℃热击7min；冰上放置12min； | Day 1 12:00 |
| ⑩ | 10000 rpm室温离心10s，弃上清； | Day 1 12:00 |
| ⑪ | 用1 mL 1×TE重悬菌体沉淀，10000rpm离心10s，弃上清； | Day 1 12:00 |
| ⑫ | 重复1次；⑪ | Day 1 12:00 |
| ⑬ | 加入1 mL 1×TE，取500 μL， 300 μL， 200 μL涂至筛选培养基SC-U/2%(w/v)葡萄糖平板上（+Amp），倒置30℃培养箱中； | Day 1 12:00 |
| ⑭ | 菌落生长3~4天，挑取单克隆进行PCR检测。 | Day 4 12:00 |

转基因酵母的耐胁迫测试

| 顺序 | 工作 | 最佳时间点 |
| —- | —- | |
| ① | 挑阳性单克隆酵母接种至10mL SC-U/2%(W/V)葡萄糖液体培养基中（+Amp）。30℃摇床培养24h。 | Day 1 8:00 |
| ② | 测定菌液OD600，将菌液接种到10mL诱导表达培养基 SC-U/2%(W/V)半乳糖液体培养基中（+Amp），调节菌液OD600为0.4；30℃摇床培养36h以促进外源基因表达。 | Day 2 8:00 |
| ③ | 吸取200μL菌液，调节菌液OD600为1，10000rpm室温瞬时离心10s，弃上清，加上等量的30%(W/V)PEG-6000或250 mM ABA 或 5 M NaCl 或 无菌水（对照），在30℃培养箱中处理36h。3次重复。 | Day 3 18:00 |
| ④ | 将处理后的菌液连续10倍稀释（1，10^-1^，10^-2^，10^-3^，10^-4^，10^-5^，10^-6^）吸取2μL稀释液点样到SC-U/2%(W/V)葡萄糖平板上（+Amp），倒扣于30℃培养箱中，培养3-4天，观察菌落生长并拍照，记录。 | Day 5 8:00 |
| ⑤ | 拍照，在植绒布之上。 | Day 8 8:00 |

OD值的计算

V葡萄糖（自己打算吸取的液体体积，可以自己定）X OD600测定（在调节前测得）= V半乳糖中间值 X 0.4（0.4为目标OD600值）

若V葡萄糖，即自己打算加入到调节后的液体中的原葡萄糖菌液体积，为1 ml，且OD600测定（在调节前测得）为0.8，

则有 V半乳糖中间值= 2 ml

则有 V半乳糖加入值= 10 -2 =8 ml

则有，原葡萄糖加入1 ml，后半乳糖加入 8 ml

第二次OD值调节后需要离心

200 微升（原菌液加入量） X OD600测定（在调节前测得）= V胁迫溶液中间值 X 0.4（0.4为目标OD600值）

则有 V胁迫液体加入量=200 微升 +V胁迫溶液中间值

若该中间值为20，则有 V胁迫液体加入量=220微升

稀释的注意事项

稀释时，用ddH2O稀释，取上一梯度的溶液10微升至下一梯度的管子中，再在下一梯度管子中加入90微升的ddH2O

所需溶液的配制

（1）==10×TE==： 称取1.21gTris，0.37gEDTA，去离子水定容至100mL，调节pH至7.5（HCl），过滤灭菌或121℃高压灭菌15min。室温保存备用。
（2）==1×TE==：用灭菌去离子水稀释10×TE10倍。
（3）==10xLiAc==：称取10.2g醋酸锂，去离子水定容至100mL，调节pH至7.5，过滤灭菌或121℃高压灭菌15min。室温保存备用。
（4）==1xLiAc==：用灭菌去离子水稀释10×LiAc 10倍。
（5）==1xLiAc/0.5×TE==：加入10mL10xLiAc，5mL10xTE，去离子水定容至100mL，过滤灭菌室温保存备用。
（6）==1xLiAc/40%PEG-3350/1×TE==：加入10mL10xLiAc，10mL10×TE，80mL50%PEG-3350，混匀后过滤灭菌室温保存备用。
（7）==50%PEG-3350==：称取50gPEG-3350，去离子水定容至100mL，过滤灭菌或121℃高压灭菌15min。室温保存备用。
（3）==YPD培养基（固体）==：1%酵母提取物10g/L，2%胰蛋白胨20g/L，2%D-葡萄糖20g/L，2%琼脂粉20g/L，去离子水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。25mL每等份倒培养基，并24度保存备用。
（6）==SC-U-葡萄糖培养基（液体）==：YNB（yeast nitrogen base）6.7g/L，U-DO（Ura DO Supplement）0.77g/L，D-葡萄糖20g/L，去离子水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。25mL每等份倒培养基，并24C保存备用。
（7）==SC-U-半乳糖培养基（液体）==：YNB（yeast nitrogen base）6.7g/L，U-DO（Ura DO Supplement）0.77g/L，半乳糖20g/L，去离子水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。24C保存备用。