qRT-PCR流程
1 准备材料
A引物，顶部和底部引物，Bmix，CddH2O,D各处理下的cDNA，E各规格10，100，200，1000微升的枪头和移液枪，F50毫升离心管，G离心机，H震荡仪，I-20度冰箱，J制冰机与冰盒，KqRT-PCR机，L灭菌锅，M烘锅
2 稀释引物
在所有工作开始之前，请务必保证已经穿好实验服，已经戴好一次性手套，已经使用酒精对手套和袖子进行灭菌操作。
①将引物与备份分开。一般我们设计的引物，若OD数为2，公司会将一对引物（包含顶部和底部）制作两份交给我们。这时我们需要在引物盒将备份与做实验要用的那一份分开，引物在引物盒内的分布一般是有规律可循的。
②将做实验需用的那份引物进行离心，30s，12000转速。注意好配平与盖好盖子。
③将ddH2O分装至50毫升离心管内。注意离心管应当灭过菌。
④使用1000微升的枪头和移液枪按每个引物上注明的加水量加入ddH2O。如若枪头接触管壁，务必换枪头，不可快速吸取和排出液体，吸取液体，在空中将枪向下按至1档位，深入加入的液体中慢慢松开拇指进行吸取，排出液体时，应当悬空缓慢按下挤出液体，注意挤出液体时，拇指应当按至最底部档位。另注意枪不可倒立放置，会造成枪的损毁。
⑤所有引物稀释好后，先在震荡仪上进行2-3s的震荡后，再在离心机上进心30s，12000转速的离心。如若当前不进行下一步操作，请将制备好的稀释引物的盒子上注明稀释日期后，放回-20度冰箱。
3 开始点样
在工作前，请准备好：
稀释好的一对引物（从-20度内取出，刚化时就要吸取，避免反复冻融）,
ddH2O,
MIX（从-20度内取出，刚化时就要吸取，避免反复冻融）,(有的可能用到buffer),
cDNA(各处理与对照CK，刚化时就要吸取，避免反复冻融，而且需要避光进行，加cDNA的过程不应该长于30min，如3H-ROOT-DROUGHT,24H-ROOT-DROUGHT)，
qRT-PCR机器专用八连管与盖子
冰盒与冰板
①配置预混液
| 预混液配置 | |||
|---|---|---|---|
| 1 | MIX | 5μL*12=60μL | 合计9μL乘12倍为108微升 使用引物类似的离心管 |
| 2 | 引物1 | 0.2μL*12=2.4μL | |
| 3 | 引物2 | 0.2μL*12=2.4μL | |
| 4 | ddH2O | 3.6μL*12=43.2μL | |
| 5 | cDNA | 1μL | 每个管子加入的cDNA不同，最后点样再加，预混液中不加 |
因为我们要对同一个基因的不同处理使用的是同样的混合液，所以根据我有3个处理*3个重复=
9个点样,根据经验，我们应该在配置预混液时将各组分乘以12倍（配置9倍会导致最后几个管子加不够，因为移液有误差和损失），预混液在15μL的离心管内配置，该过程请在冰盒和冰板上进行，在液体刚化时就要吸液，不可完全融化，先加容量大的组分，最后加少的，加少的时，移液枪可插入液面后将液体全部推出。
②设计八连管排列
| Qrt-PCR | 96孔板规划 | 批次: | 01批次 | 日期： | 2021年 | 12月 | 日 | 周 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 一 | 二 | 三 | 四 | 五 | 六 | 七 | 八 | 九 | 十 | 十一 | 十二 | |
| CK | CK | CK | 3H | 3H | 3H | 24H | 24H | 24H | CK | 3H | 24H | |
| 一 | MaRab1 | MaRab1 | MaRab1 | MaRab1 | MaRab1 | MaRab1 | MaRab1 | MaRab1 | MaRab1 | MaRab23 | MaRab23 | MaRab23 |
| 二 | MaRab5 | MaRab5 | MaRab5 | MaRab5 | MaRab5 | MaRab5 | MaRab5 | MaRab5 | MaRab5 | MaRab23 | MaRab23 | MaRab23 |
| 三 | MaRab11 | MaRab11 | MaRab11 | MaRab11 | MaRab11 | MaRab11 | MaRab11 | MaRab11 | MaRab11 | MaRab23 | MaRab23 | MaRab23 |
| 四 | MaRab13 | MaRab13 | MaRab13 | MaRab13 | MaRab13 | MaRab13 | MaRab13 | MaRab13 | MaRab13 | MaRab25 | MaRab25 | MaRab25 |
| 五 | MaRab15 | MaRab15 | MaRab15 | MaRab15 | MaRab15 | MaRab15 | MaRab15 | MaRab15 | MaRab15 | MaRab25 | MaRab25 | MaRab25 |
| 六 | MaRab17 | MaRab17 | MaRab17 | MaRab17 | MaRab17 | MaRab17 | MaRab17 | MaRab17 | MaRab17 | MaRab25 | MaRab25 | MaRab25 |
| 七 | MaRab19 | MaRab19 | MaRab19 | MaRab19 | MaRab19 | MaRab19 | MaRab19 | MaRab19 | MaRab19 | |||
| 八 | Acting | Acting | Acting | Acting | Acting | Acting | Acting | Acting | Acting |
③先对预混液进行9000X的瞬时离心，再将预混液分装入八连管，每管（9μL），注意枪头更换，是否吸取到液体
④将cDNA从-20度取出，将各处理的cDNA分别取1μL加入你规划的八连管中，该过程请在冰盒和冰板上进行，在液体刚化时就要吸液，不可完全融化，避光30min内进行。
⑤对八连管进行标记（八连管尾部和头部有个小孔，其左右朝向方位不同，可指示位置），之后放入离心机，进行9000X的瞬时离心。若暂时无法进行qRT-PCR,应当将其放在冰盒内，避光保存。
⑥将所有样品按照规划放入qRT-PCR机器内，在电脑中输入样品标记，温度程序，开始允许，该过程会持续1h08min。
⑦将数据导出后，进行系列运算后，得到RPKM值。
⑧进行origin绘图。
